制備微生物檢測培養(yǎng)基細節(jié)問題
一、稱取
用度1/100的電子天平稱取培養(yǎng)基所需藥品。先根據(jù)配方計算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量,然后用天平稱取。稱量時用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品。
二、溶化
培養(yǎng)基放入燒杯或搪瓷缸中,慢慢加入少量所需水,邊加入邊用玻棒攪拌。如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂,培養(yǎng)基不需要加熱;如果含有瓊脂,則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸,溶解后,再補齊所需水,并攪拌均勻(如圖3所示)。如果配制的培養(yǎng)基量很大,可用不銹鋼鍋加熱溶化,可先用溫水加熱并隨時攪動,防止焦化,如有焦化現(xiàn)象,配制的培養(yǎng)基就不能使用,要重新配制。
配制培養(yǎng)基時不可用銅或鐵的容器溶化,因銅或鐵制容器可能會使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量標,影響實驗(培養(yǎng)基中銅含量大于0.3mg/L,細菌不宜生長,鐵含量過0.14mg/L,妨礙細菌產(chǎn)毒素)。對容易發(fā)生反應,產(chǎn)生沉淀的藥品,要分開溶解,后加入培養(yǎng)基,如磷酸氫二鉀和硫酸鎂。
三、調(diào)pH
雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分,能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi),但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求,就要進行必要的調(diào)整。如果有已校準pH計,可用pH計,如果沒有,可用精密的pH試紙,再根據(jù)需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸(微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸)調(diào)制所需的pH。培基的pH一般為7.4~7.6,也有酸性或堿性的。用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基,在調(diào)整pH時要調(diào)至高出所需0.1個~0.2個單位,因用氫氧化鈉調(diào)整時,高壓滅菌后,培養(yǎng)基的pH要降低0.1~0.2。如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分,可不pH。
四、過濾
配成的培養(yǎng)基,若無特殊要求,可省略此步。若有沉淀或渾濁.需要澄清的.液體培養(yǎng)基可用油紙過濾。而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過濾。如果過濾法還不能達到澄清的要求,則可用蛋清澄清法,即培養(yǎng)基加熱冷卻到50~60℃,裝入三角瓶內(nèi)(不過容量的二分之一),按1000mL加人1個~2個雞蛋的蛋清,用力搖晃3-5min,高壓蒸汽滅菌121℃、20min,取出趁熱過濾即可。
五、分裝
配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中,分裝試管,如果試管量很大,可用自動分液器,如果試管量少,可用漏斗分裝。分裝量不過容器容積的三分之二。三角瓶以不過容積的二分之一為宜;瓊脂斜面以不過試管長度的五分之一為宜,滅菌后,擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一,底層為三分之二的量為宜;半固體瓊脂分裝量為試管長度的三分之一;用來接種或保菌的高層瓊脂,分裝量為試管長度的四分之一或三分之一,用來接種厭氧菌的要達到三分之二;瓊脂平板,內(nèi)徑為90mm的以13mL~15 mL為宜,內(nèi)徑70mm的平板為8mL~10 mL,制成的瓊脂平板若表面水分較多,可將平板倒扣,放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min,干燥后再用。每批培養(yǎng)基應另外分裝一小玻璃瓶(約20mL)與該批培養(yǎng)基同時滅菌,為測定該批培養(yǎng)基pH。
六、滅菌
分裝好的培養(yǎng)基應立即進行滅菌。滅菌的方法種類如下:
1. 高壓蒸汽滅菌法
大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法,小量分裝時,用121℃,15min;滅菌量大時,用121℃,30min滅菌;含糖類的培養(yǎng)基只能113~115℃,15min滅菌,避免糖類遭破壞。
2.煮沸滅菌法
對含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基,可使用此方法。
3.過濾除菌
以過濾的方法除菌,用無菌操作技術(shù),定量加入培養(yǎng)基。血液、抗生素可用無菌操作技術(shù)抽取,加入冷卻到50℃左右的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時,可用此法。
對LST培養(yǎng)基進行滅菌時,有時發(fā)酵管內(nèi)會有氣泡。為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡,可以采取以下幾項措施:
1. 小倒管浸滿培養(yǎng)基(不留氣泡)后再加入到盛LST的試管中。
2.滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前,將鍋內(nèi)氣體排干凈。
3.試管塞不要塞得太緊(使用硅膠塞的時候),勿使用橡皮塞。
4不要過早打開滅菌鍋,要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時再打開滅菌鍋。
如果以上情況都做到還有氣泡,可用水做培養(yǎng)基組的對照試驗,若培養(yǎng)基組有氣泡,而對照組沒有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因。
七、倒平板
滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃后,倒入無菌干燥的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基的溫度不能過高,否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水;溫度太低,培養(yǎng)基又容易凝固成塊,無法制成平板。倒平板時,應在靠近酒精燈火焰進行,以免外界的雜菌落入平板內(nèi),左手拿培養(yǎng)皿,右手拿三角瓶的底部,用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下,灼燒瓶口,用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開一條縫,至瓶口剛好伸入,倒入培養(yǎng)基,以鋪滿底為限,不過培養(yǎng)皿高度的三分之一,迅速蓋好蓋,放在桌面上,輕輕地轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)基分布均勻,冷凝后即可。
八、擺斜面
裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基,在滅菌完成后,趁熱立即擺放在木棒(或玻璃棒)上,并成適當?shù)男倍?,冷卻后,瓊脂凝固即成斜面。斜面長度不用過試管二分之一。
九、質(zhì)量檢查
培養(yǎng)基滅菌后仔細檢查一遍,發(fā)現(xiàn)有破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染,都要丟棄,不能再用。并測定其pH。還需進行無菌檢查和效果檢查。無菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管(瓶)~2管(瓶),37℃恒溫培養(yǎng)1d~2d,確定無雜菌生長;效果檢查是用標準菌株接種在相關(guān)的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長、形態(tài)及生化情況,與已知情況相符。兩種情況都合格,配制的培養(yǎng)基方可使用。
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